限制性內(nèi)切酶: 使用前需要考慮的五件事 自20世紀(jì)70年代以來(lái)，使用限制酶來(lái)表征DNA的方法一直很受歡迎。如今，這種技術(shù)仍然是評(píng)估DNA序列簡(jiǎn)單、快速的方法之一。與大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室試劑一樣，限制性內(nèi)切酶可能是變化無(wú)常的。無(wú)論你是簡(jiǎn)單地消化一個(gè)質(zhì)粒，還是執(zhí)行復(fù)雜的克隆或篩選程序，都需要考慮幾個(gè)主要的因素:
正確的使用條件
每一種酶都是不同的，需要特定的條件，例如:
BSA是許多限制性酶的穩(wěn)定劑；有些酶不能長(zhǎng)時(shí)間工作超過(guò)1-2個(gè)小時(shí)
大多數(shù)限制性酶在pH 7.2和pH 8.5之間有效地消化，使用合適的緩沖液很重要。
大多數(shù)商業(yè)供應(yīng)商都有他們自己選擇和使用限制性內(nèi)切酶的特別指南，使用前應(yīng)了解清楚。
在雙重限制性酶消化時(shí)，如果兩種酶的佳條件不同，你可能需要部分地犧牲一種酶的活性。在分析結(jié)果時(shí)要考慮這一點(diǎn)。或者，可以進(jìn)行連續(xù)的消化，先使用種酶，凝膠提取去除緩沖液組分，然后用第二種酶消化。如果使用這種方法，開(kāi)始用多個(gè)管子進(jìn)行相同反應(yīng)可能是明智的，因?yàn)樵谀z提取過(guò)程中，可能會(huì)丟失很多材料。
甲基化作用
當(dāng)細(xì)菌復(fù)制一個(gè)質(zhì)粒時(shí)，它們通常將特定的CpG島甲基化。這些序列通常是甲基化的目標(biāo)。 限制性酶切位點(diǎn)也可能由于與甲基化位點(diǎn)有重疊而無(wú)法切割。此時(shí)，限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與旁側(cè)的序列恰巧組成Dam或者Dcm識(shí)別位點(diǎn)，并進(jìn)而被甲基化而阻斷切割。因此在質(zhì)粒構(gòu)建設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)，要充分考慮到這種情況。
在實(shí)驗(yàn)室大腸桿菌菌株中有三種不同類型的甲基化酶: Dam甲基化酶、Dcm甲基轉(zhuǎn)移酶和EcoKI甲基化酶。如果你想要消化一個(gè)可能被甲基化的限制位點(diǎn)，你可以使用一個(gè)甲基化無(wú)能力的大腸桿菌菌株(JM11)來(lái)繁殖你的質(zhì)粒。這些大腸桿菌菌株無(wú)法甲基化DNA，從而你的限制性酶可以裂解CpG島。
星活性小化
一些限制酶在特定的條件下，它們可能會(huì)變得雜亂，隨機(jī)消化DNA，而不是在特定的識(shí)別位點(diǎn)。這種現(xiàn)象被稱為星活性，通常是由長(zhǎng)時(shí)間的潛伏期或緩沖條件不佳(如pH)引起的。因此，使用所需的酶與推薦的緩沖液是至關(guān)重要的。
此外，高甘油濃度可能會(huì)導(dǎo)致星活性增加。由于大多數(shù)酶和它們的緩沖液都被包裝成甘油來(lái)延長(zhǎng)保質(zhì)期，所以你應(yīng)該充分稀釋緩沖液和酶。這也是為什么許多公司在他們的通用步驟建議20 - 50?l反應(yīng)體系和提供10 x緩沖液。
給你的酶一些空間
某些酶在識(shí)別位點(diǎn)兩邊有幾個(gè)堿基對(duì)時(shí)效率高。如果你要用雙切，兩種酶位置比較緊密，或者消化PCR產(chǎn)物的末端時(shí)，這一點(diǎn)尤其重要。
每個(gè)制造商對(duì)他們的產(chǎn)品都有具體的建議，但通常建議確保在識(shí)別位點(diǎn)的兩邊至少有6個(gè)堿基對(duì)。添加更多堿基對(duì)的簡(jiǎn)單方法是通過(guò)PCR引物進(jìn)行設(shè)計(jì)。盡量避免帶有引物二聚體形成風(fēng)險(xiǎn)的序列。
同裂酶和異裂酶
有時(shí)你需要使用一種特殊的酶，它的條件并不適合你的實(shí)驗(yàn)設(shè)置。在這種情況下，同裂酶可能會(huì)幫助你進(jìn)行你的實(shí)驗(yàn)，而不會(huì)嚴(yán)重影響你的終結(jié)果。
同裂酶是兩種能識(shí)別相同的位點(diǎn)，但具有不同性質(zhì)的限制性酶，通常來(lái)自不同的細(xì)菌體系。例如，SinI 和AvaII 都都識(shí)別序列G / G(A或T)CC。然而，AvaII是甲基化敏感的，而SinI不是。因此，如果你想要切斷這個(gè)序列，并且不想使用甲基化不敏感的大腸桿菌菌株，那么SinI可以滿足條件，而AvaII則不會(huì)。
兩種酶具有相同的識(shí)別位點(diǎn)，但在不同的堿基對(duì)上切割被稱為異裂酶。這可能有助于避免星活性和甲基化敏感性。例如， KpnI和Acc65I都識(shí)別這個(gè)位點(diǎn):GGTACC，但在不同的位置切割。KpnI切割bp 5:GGTAC / C，而Acc65I切割bp 1:G / GTACC。KpnI可能會(huì)顯示出星活性，而Acc65I則更強(qiáng)健。因此，如果切割位置不重要，Acc65I可能是一個(gè)更好的選擇。
